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Dissertação de Mestrado em Ciências Biomédicas, Universidade Nova de Lisboa, 2008

Mestrado em Ciências Biomédicas, Especialidade de Biologia Molecular em Medicina Tropical e Internacional

Actualmente, com o aumento do número de amostras de sangue colhidas, o uso ou não de anticoagulante (consoante o tipo de testes laboratoriais a executar), o modo como a colheita é efectuada e o estado psíquico do doente tem muita influência na mesma colheita. Por vezes as colheitas são efectuadas por pessoas, que na maior parte das vezes, poucos conhecimentos têm sobre anticoagulantes. Se não possuírem os conhecimentos certos sobre os anticoagulantes, o modo como o transporte das amostras são efectuadas para o laboratório, o doente pode ser o principal prejudicado, pois pode ser submetido a nova colheita. O sistema hemostático é composto por diversos componentes, entre os quais se encontram as plaquetas, os vasos sanguíneos, as proteínas da coagulação, os anticoagulantes naturais e o sistema de fibrinólise. A hemostase torna-se assim num dos mais básicos mecanismos de defesa do organismo, pois preserva a integridade da circulação e limita a perda de sangue num vaso lesado. A coagulação é dependente de uma série complexa de interacções, nas quais o sangue perde as suas características de fluido, sendo convertido numa massa semi-sólida, formando um coágulo irreversível. A formação do coágulo sanguíneo está dependente de um conjunto de proteínas existentes no plasma, designados factores de coagulação. Normalmente estes factores encontram-se inactivos e não dão origem à coagulação, mas se um tecido estiver lesado os factores de coagulação são activados, produzindo, desta forma, coágulos. O sangue para prevenir a coagulação contém vários anticoagulantes, que impedem os factores de coagulação iniciar a formação de coágulos. Antitrombina, Heparina e Prostaciclina são exemplos de anticoagulantes que actuam no sangue. A coagulação “in vitro” envolve a transformação da fibrina em fibrinogénio. Assim, os anticoagulantes usados nos tubos para evitar a coagulação do sangue usado em exames laboratoriais e em transfusões sanguíneas são necessários. Heparina, EDTA e o Citrato de Sódio são os principais exemplos de anticoagulantes “in vitro”. Os anticoagulantes são usados quanto temos necessidade de obter sangue total ou plasma. Não existe um anticoagulante ideal para todos os exames laboratoriais. Em geral, os anticoagulantes têm como principal papel a interrupção da activação da cascata de coagulação, inibindo a formação da protrombina, impossibilitando a formação do coágulo. Concluindo é necessário saber quais os anticoagulantes utilizados na prática laboratorial e que doseamentos se podem efectuar com cada anticoagulante.

O Streptococcus pyogenes é uma bactéria que pode colonizar o epitélio da mucosa da orofaringe e a camada epidérmica da pele, mas também a vagina, o ânus e o couro cabeludo, em menor proporção. Contudo, esta bactéria apresenta uma grande capacidade de adaptação a diversas condições fisiológicas, permitindo-lhe provocar um largo espectro de patologias divididas em: localização (amigdalite/faringite e infecções de feridas); invasivas (fasceíte necrosante, osteomielite e bacteriémia); mediadas por toxinas (escarlatina e a síndrome de choque tóxico estreptocócico); e pós-estreptocócicas (febre reumática e a glomerulonefrite pós-estreptocócica). Os principais objectivos deste trabalho são avaliar as características epidemiológicas do Streptococcus pyogenes num Hospital Distrital Português determinando a patologia mais frequente causada por esta bactéria de acordo com o diagnóstico clínico, o escalão etário mais afectado pela infecção e a variação sazonal deste agente etiológico durante o período de 1 de Janeiro de 2008 e 31 de Dezembro de 2009. Os dados utilizados para a realização deste estudo retrospectivo foram recolhidos de pacientes que deram entrada nos diversos serviços hospitalares de um Hospital Distrital com cultura positiva para Streptococcus pyogenes entre Janeiro de 2008 e Dezembro de 2009. O tratamento dos dados foi realizado em SPSS 17.0. Após a recolha de dados, foram obtidos um total de 476 amostras com cultura positiva para Streptococcus pyogenes, sendo a maioria exsudatos orofaríngeos (97,9%). Desta forma, optou-se por tratar a parte mais relevante da estatística, restringindo o estudo a esta fracção. A patologia mais frequente de acordo com o diagnóstico clínico foi a amigdalite. Contudo, 7,1% das culturas positivas não indicavam diagnóstico. Para determinar o escalão etário mais afectado pelas infecções de Streptococcus pyogenes no Hospital Distrital durante o período de estudo dividiu-se a população de estudo por 5 escalões, sendo o escalão pré-escolar o mais afectado. Quanto à variação sazonal de um ano para outro ressalta a variabilidade do número de infecções, bem como, a discrepância da percentagem de infecções ao longo do ano. Em 2008, observam-se algumas variações atípicas. Em 2009, o número de infecções encontra-se bem distribuído ao longo do ano, mantendo uma variação sazonal relativamente constante entre os 5 e os 9%. Os Streptococcus pyogenes isolados neste hospital afectam maioritariamente crianças entre os 3 e os 5anos causando amigdalite. Quanto à variação sazonal é inconclusiva, dada a discrepância de 2008 para 2009 e a falta de dados epidemiológicos portugueses publicados sobre a bactéria em questão. Desta forma, seria importante avaliar esta variação em estudos futuros, de modo a conseguir um encadeamento lógico desta variabilidade.

Actualmente, a malária continua a ser um problema de saúde à escala global, provocando cerca de 1,5 a 2,7 milhões de mortes anuais. A patologia é causada por um parasita do género Plasmodium, existindo quatro espécies capazes de infectar humanos: P. vivax, P. falciparum, P. ovale e P. malariae. A sua transmissão ocorre principalmente através da picada da fêmea do mosquito do género Anopheles. A malária foi endémica na região do Mediterrâneo, no decorrer do século XX, nomeadamente em Portugal, Espanha, França, Itália, tendo depois sido combatida e dada como erradicada. Contudo, o vector (Anopheles artroparvus) continua amplamente distribuído no território nacional. A sua presença aliada à existência de casos importados e a alterações climáticas cada vez mais acentuadas, aumentam exponencialmente a possibilidade de infecções endémicas futuras. Com base em estudos realizados, verifica-se que, teoricamente, é possível a existência de surtos endémicos de malária em Portugal Continental, contudo o risco real da sua real ocorrência é ainda baixo. Isto deve-se ao facto de existir fraca competência vectorial, bem como pela baixa prevalência de indivíduos previamente infectados e transmissores da doença. Sugere-se que um aumento de 0,5ºC possa corresponder a uma elevação de 30-100% na densidade populacional do vector, evidenciando assim que modificações climáticas futuras podem alterar as condições previamente referidas.

As infecções provocadas pelo VIH e VHC estão disseminadas por toda a população, sem atender ao extracto social, idade ou sexo. A partir de uma abordagem dos aspectos clínicos e epidemiológicos destes vírus e, sabendo que Portugal tem aproximadamente 12 milhões de habitantes, este artigo pretende identificar a percentagem de doentes com VIH e VHC positivos nos Serviços da Unidade Local de Saúde E.P.E. de Castelo Branco e, verificar a existência ou não de casos de co-infecção. Para tal, efectuou-se a recolha dos resultados de análises ao VIH e VHC realizados no ano 2009. Registaram-se 1178 amostras das quais 460 eram indivíduos do sexo masculino e 718 do sexo feminino, com um intervalo de idades dos 3 meses aos 99 anos. Os dados recolhidos foram submetidos a tratamento estatístico utilizando o programa SPSS versão 17.0. Os resultados depois de analisados mostraram que existe uma maior percentagem de infecção por VIH em indivíduos do sexo masculino em relação ao sexo feminino. O mesmo se verificou em relação à infecção por VHC na qual existe uma maior percentagem em indivíduos do sexo masculino. Constatou-se também que o Serviço Hospitalar com maior prevalência de VIH positivos foi o Serviço de Internamento de Psiquiatria seguido dos Serviços de Laboratório e de Urgência de Medicina ao passo que, os Serviços da área da Gastro/Hepatologia, Diálise e Psiquiatria registaram uma maior prevalência de indivíduos VHC positivos. A nível de co-infecção VIH/VHC positivos foi identificado um indivíduo do sexo masculino com 37 anos de idade, proveniente do Serviço de Psiquiatria. Conclui-se que, os resultados obtidos estão de acordo com outros estudos feitos a nível Europeu e Mundial, podendo afirmar-se que a nossa realidade é similar à de outros países.

A Diabetes Mellitus Gestacional (DMG) é o distúrbio metabólico mais comum na gravidez, afectando 1 a 10% de todas as grávidas. Diversos estudos demonstram amplas diferenças na prevalência da doença devido a diferentes critérios de screening/diagnóstico aplicados e às características da população em estudo. Segundo a Sociedade Portuguesa de Diabetologia, os critérios actualmente adoptados em Portugal para diagnóstico da DMG são os da 4ª Conferência Internacional sobre Diabetes Gestacional, em tudo semelhantes aos da American Diabetes Association (ADA). Objectivos: Avaliar se uma Prova de Sullivan (PS) positiva (glicémia ≥ 140 mg/dl), implica sempre a positividade da Prova de Tolerância à Glucose Oral (PTGO) com 100g de glucose, em mulheres no 2ºTrimestre de gestação, seguidas no Hospital Infante D.Pedro (Aveiro, Portugal). Pretende-se ainda verificar se existe associação entre a idade materna avançada (≥ 30 anos), a Hipertensão (HTA), a gravidez gemelar e o risco de desenvolver DMG, nesta população. Material e métodos: Trata-se de um estudo retrospectivo, no qual se seleccionaram dados no Sistema Informático do Laboratório (LIS), de mulheres no 2º Trimestre de gestação que já tivessem efectuado a PS e PTGO com 100g de glucose. Os dados incluíram os valores de glicémia no soro correspondentes a ambas as provas, idade materna e diagnóstico. Posteriormente, foram analisados estatisticamente (SPSS 7.0). Neste estudo utilizaram-se os critérios da American Diabetes Association (ADA). Resultados: 125 mulheres já tinham realizado PS e PTGO com 100g de glucose no 2ºTrimestre de gestação. Ao relacionar ambas as provas, foram identificados 4 falsos negativos para PS (3,2%), 84 falsos positivos (67,2%) e 14 (11,2%) verdadeiros positivos (com DMG); 18 grávidas apresentaram HTA, sendo que apenas 2 tinham em simultâneo HTA e DMG; Observou-se a presença de 10 mulheres com gravidez gemelar, sendo que nenhuma apresentava DMG. Conclusão: A positividade para PS não implica sempre positividade para PTGO, uma vez que foram detectados muitos falsos positivos (PS positiva e PTGO negativa), devido à prova de screening utilizada; Idade materna ≥ 30 anos, constitui um factor de risco para a DMG na população em estudo; Para determinar se a HTA e a gravidez gemelar constituem um factor de risco para desenvolver DMG nesta população, seria importante a obtenção de mais informações clínicas.

A hidatidose apresenta uma distribuição cosmopolita e encontra-se entre as zoonoses de maior importância a nível mundial. O parasita Echinococcus granulosus, responsável por esta doença, apresenta uma distribuição cosmopolita afectando diversas espécies de animais e, acidentalmente, o Homem. O objectivo do estudo é a obtenção do estado larvar do E. granulosus (protoescólices) para o estudo da fertilidade dos quistos em diferentes espécies animais em Portugal. MATERIAL E MÉTODOS: Para este estudo foi utilizado material biológico parasitado, obtido em matadouros públicos e privados da zona centro (Castelo Branco, Pedrógão e Guarda), recolhido entre Outubro de 2007 e Março de 2010. Procedeu-se à extracção do conteúdo dos quistos hidáticos (líquido e areia hidáticos). E através da observação ao microscópio óptico, observou-se a presença de protoescólices e/ou ganchos, bem como o seu estado de conservação e a presença de elementos estranhos. As amostras férteis foram conservadas a - 20ºC para posteriores trabalhos. RESULTADOS: Foram analisadas um total de 95 amostras de quistos hidáticos provenientes do fígado e pulmão de ovinos, bovinos e caprinos e estabelecida uma relação entre a fertilidade/infertilidade dos quistos e os órgãos parasitados. Relativamente à espécie hospedeira e faixa etária do animal parasitado, os resultados obtidos não foram estatisticamente significativos. DISCUSSÃO: Foi encontrada uma associação entre a fertilidade dos quistos hidáticos e órgão parasitado, apresentando uma relação semelhante às obtidas em estudos do mesmo género efectuados noutras zonas endémicas.

O céstode E. granulosus, agente causal da hidatidose/equinococose, está presente em diversas espécies de animais e, ocidentalmente, em humanos. Este apresenta uma grande variabilidade genética, com dez genótipos diferentes descritos (G1 – G10) onde alguns destes já são considerados novas espécies. Estes genótipos encontram-se distribuídos um pouco por todo o mundo, inclusive Portugal. O presente trabalho tem como objectivo comparar diferentes métodos de extracção de DNA para E. granulosus. MATERIAL E MÉTODOS: Procedeu-se à extracção de DNA de 20 amostras usando 3 kits comerciais, “High pure PCR template preparation kit”, “Easy spin kit”, “QIAamp DNA mini kit” e a extracção manual, com algumas modificações. Posteriormente foi efectuada a quantificação do DNA extraído, com obtenção do grau de pureza por densidade óptica (DO) a 230nm, 260nm e 280nm (GeneQuant, BIORAD) RESULTADOS: Foram obtidos diferentes resultados consoante método utilizado, variando a concentração de DNA entre 9,72±8,49ng/µL para “QIAamp DNA mini kit” (Qiagen) e 224,1±6,5ng/µL para o método de extracção manual (modificado). Em relação pureza do DNA, obtida a uma densidade óptica (DO) de 260/280nm, houve uma variação entre 0,21±0,12 para “Easy spin kit” (Citomed) e 1,82±0,34 para “High pure PCR template preparation kit” (Roche). DISCUSSÃO: O método de extracção manual modificado revelou-se o mais eficiente na extracção. Em relação à pureza do DNA obtido, os que melhores razões obtiveram foram o “High pure PCR template preparation kit” (Roche, Portugal) e o método de extracção manual (modificado), sendo que todos os outros registaram valores que indicam a presença de impurezas no DNA. Assim, poderemos inferir que o melhor kit para a extracção de DNA de E.granulosus é o método manual (modificado), visto ser aquele que maior quantidade de DNA extrai.

F. hepatica é o agente etiológico da Fasciolose humana/animal, e tem a capacidade de parasitar diversas espécies animais, principalmente herbívoros e omnívoros (ovinos, bovinos, caprinos, etc.) onde pode ser encontrado no fígado e canais biliares, tendo também a capacidade, de acidentalmente infetar o Homem. Este parasita apresenta uma distribuição cosmopolita sendo mais frequente em regiões pantanosas sujeitas a inundações periódicas. Foi efetuada a extração de DNA de um exemplar de F. hepatica obtido no matadouro de Pedrogão Grande, através do método manual de fenol-clorofórmio. As regiões ribossomais intergénicas transcritas ITS1 e ITS2 foram amplificadas em duas reações separadas, com os primers BD1/4S (Bowles, et al., 1993c) e Dd58SF1/Dd28SR1 (Sharroks, 1994), respetivamente. Os produtos de amplificação das reações foram purificados com o kit “QIAquick PCR purification kit” e sequenciados pela empresa STAB VIDA (Portugal), através do método de Sanger. No final procedeu-se ao tratamento e análise filogenética das sequências obtidas através de software apropriado, culminando com a criação de redes filogenéticas pelo programa SplitsTree4, usando distâncias calculadas através do parâmetro Kimura-2 no algoritmo Neighbor-Net. Após se efetuar a amplificação regiões alvo (ITS1 e ITS2) e respetiva análise filogenética verificou-se que estas eram diferentes de todas as que estavam descritas na base de dados do GenBank. A região ITS1 do exemplar estudado está mais próxima filogeneticamente de amostras do continente asiático (AJ628432, AJ628431, EF612469 e EF612468), do continente africano (EF612467 e EF198867) e do continente americano (AJ243016), com um único local polimórfico de diferença entre as sequências referidas e a sequência estudada. A região ITS2 estava próxima filogeneticamente de sequências descritas um pouco por todo o mundo, apresentando 2 locais polimórficos em relação às sequências descritas na base de dados. Este será portanto um novo haplótipo de ITS1 e ITS2 para F. hepatica e a primeira sequência obtida desta região para esta espécie em Portugal.

Infection by the larval stage of the cestode Echinococcus granulosus causes a disease known as cystic echinococcosis or hydatidosis, which is one of the most widespread zoonotic infections of veterinary and medical importance. Numerous studies have shown that E. granulosus exists as a complex of strains differing in a wide variety of criteria. Ten distinct genotypes (G1-G10) have been identified with potential impact on the pathology, epidemiology and the effect of the measures implemented for the control of hydatidosis. Our main objective was to carry out a preliminary analysis of the genotypes of E. granulosus circulating in the central inland region of Portugal. Parasite samples (hydatid cysts, n=27) were isolated from the liver and lung of sheep and cattle. The DNA extracted from protoscoleces isolated from the fertile cysts served a template for the PCR amplification of part of the mitochondrial cytochrome c oxidase subunit 1 (cox1), ATP synthase F0 subunit 6 (atp6) as well as the large (rrnL/16S) and small (rrnS/12S) ribosomal RNA genes. Similarity searches with homologous sequences in the databanks indicated very high similarity with references assigned to the G1, G3 and/or G1-G3 complex of Echinococcus strains. Phylogenetic analysis (Bayesian approach) supported these observations, and confirmed the assignment of all the analyzed sequences to the G1-G3 genetic cluster.

A hidatidose é uma zoonose, causada pelo helminta Echinococcus granulosus, presente de um modo geral, em todo o globo terrestre tendo na região mediterrânica uma elevada importância. Estão descritos, para esta espécie, 10 genótipos (G1 a G10) em saúde pública ligados a diferentes hospedeiros intermediários. Das técnicas de biologia molecular utilizadas para a genotipagem do E. granulosus, umas mostraram-se mais específicas e sensíveis que outras. Assim, neste estudo, pretende-se avaliar a PCR-RFLP na genotipagem de amostras de E. granulosus provenientes de Portugal. MATERIAL E MÉTODOS Foram obtidos 30 quistos hidáticos de ovinos e bovinos parasitados com E. granulosus e procedeu-se à extracção da areia hidática contida nos quistos. Foi extraído o DNA do parasita a partir da areia hidática e amplificada a região ITS-1 com três pares de “primers” diferentes (Eg16-PCR, Eg9-PCR e ITS-1-PCR). Foram aplicadas enzimas de restrição (Alu I, Cfo I, Msp I e Rsa I) a estes produtos de amplificação, os quais foram visualizados em electroforese em gel de agarose a 2,5%. Foi ainda amplificado o gene citocromo oxidase sub-unidade I (COI) e sequenciado. As sequências obtidas foram comparadas com algumas existentes no GenBank. RESULTADOS Foram obtidos produtos de amplificação para as reacções Eg16-PCR, Eg9-PCR e ITS-1-PCR. A eficiência de reacção foi de 100% para as primeiras duas PCR e cerca de 60% para a ITS-1-PCR. Foram obtidos diferentes padrões de corte, no produto amplificado, consoante a enzima usada. CONCLUSÕES Foram encontradas algumas divergências no padrão de corte com a mesma enzima, tendo sido essas amostras amplificadas para o gene COI e sequenciadas para determinar o genótipo em questão. Verificou-se, em todas as amostras que suscitaram dúvidas com a aplicação das enzimas de restrição, que se estava perante o genótipo G1. Assim, podemos concluir que para a genotipagem da espécie E. granulosus é necessário associar à técnica PCR-RFLP uma técnica mais específica, o que está de acordo com o mencionado por Villalobos et al. (2007) e Manterola et al. (2008)

Hydatidosis is a worldwide zoonosis caused by the larval stage of the tapeworm Echinococcus granulosus. The taxonomy and phylogeny of the genus Echinococcus has been a controversial issue for several years but with the usage of molecular tools to characterize the etiological agents these aspects had been clarified and a new classification has been proposed and is now widely accepted. The aim of this work is to determine the range of genetic variability within and between Portuguese E. granulosus isolates. The Portuguese isolates obtained from sheep and goats were characterized using mitochondrial COI gene sequencing. The sequences were aligned and compared with those present in the GenBank. Preliminary results showed that the Portuguese isolates were E. granulosus sensu stricto (G1-G3 cluster). In addition, phylogenetic analysis of E. granulosus isolates, using the mitochondrial NDI and Cob partial genes, was performed using neighbour-joining (Kimura 2-parameter correction) and Bayesian analyses. The findings showed some degree of variance within single isolates and a significant degree of variance between the cluster G1-G3, where our isolates were, and the other Echinococcus sp.. Despite the variance found among Portuguese isolates, they were all localized within one robust cluster.

O carcinoma colo-retal é, atualmente motivo de grande preocupação na comunidade científica pela sua incidência. Os mais de seis mil novos casos por ano e uma taxa de mortalidade próxima dos 50%, são muito significativos. O cancro colo retal, o segundo de maior incidência na Europa e também o segundo de maior incidência e mortalidade em Portugal, mata uma pessoa a cada minuto no Mundo. As estatísticas globais da doença mostram, também, que a cada 30 segundos surge um novo caso. A pesquisa de sangue oculto nas fezes é um potente indicador da possível presença de carcinoma, podendo ser utilizado como teste de rastreio.

O céstode E. granulosus, agente causal da hidatidose/equinococose, está presente em diversas espécies de animais e, acidentalmente, em humanos. Este apresenta uma grande variabilidade genética, com dez genótipos diferentes descritos (G1 – G10), onde alguns destes já são considerados novas espécies. Estes genótipos encontram-se distribuídos um pouco por todo o mundo, inclusive Portugal. O presente trabalho teve como objectivo comparar diferentes métodos de extracção de DNA para E. granulosus, para optimização das técnicas de PCR utilizadas na sua caracterização molecular. Procedeu-se à extracção de DNA de 20 amostras usando 3 kits comerciais, “High pure PCR template preparation kit”, “Easy spin kit”, “QIAamp DNA mini kit” e a extracção manual de fenol-clorofórmio (Sambrook, 1989), com algumas modificações. Posteriormente, foi efectuada a quantificação do DNA extraído, do grau de pureza e da quantidade de sais por densidade óptica (DO) a 230nm, 260nm e 280nm (GeneQuant, BIORAD). Foi também tido em conta o tempo que demora cada extracção e o seu custo. Para de facto termos a certeza que se tratava de E.granulosus, efectuou-se a amplificação do gene mitocondrial ND1, recorrendo aos primers JB11, JB12 . Os resultados obtidos provam que o melhor método para a extracção de DNA de E.granulosus é o método manual fenol-clorofórmio (modificado) e que se tratava de E.granulosus, visto que ocorreu amplificação com os primers JB11 e JB12.