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Dissertação de Mestrado em Ciências Biomédicas, especialidade de Biologia Molecular em Medicina Tropical e Internacional apresentada ao Instituto de Higiene e Medicina Tropical da Universidade Nova de Lisboa.

O céstode E. granulosus, agente causal da hidatidose/equinococose, está presente em diversas espécies de animais e, ocidentalmente, em humanos. Este apresenta uma grande variabilidade genética, com dez genótipos diferentes descritos (G1 – G10) onde alguns destes já são considerados novas espécies. Estes genótipos encontram-se distribuídos um pouco por todo o mundo, inclusive Portugal. O presente trabalho tem como objectivo comparar diferentes métodos de extracção de DNA para E. granulosus. MATERIAL E MÉTODOS: Procedeu-se à extracção de DNA de 20 amostras usando 3 kits comerciais, “High pure PCR template preparation kit”, “Easy spin kit”, “QIAamp DNA mini kit” e a extracção manual, com algumas modificações. Posteriormente foi efectuada a quantificação do DNA extraído, com obtenção do grau de pureza por densidade óptica (DO) a 230nm, 260nm e 280nm (GeneQuant, BIORAD) RESULTADOS: Foram obtidos diferentes resultados consoante método utilizado, variando a concentração de DNA entre 9,72±8,49ng/µL para “QIAamp DNA mini kit” (Qiagen) e 224,1±6,5ng/µL para o método de extracção manual (modificado). Em relação pureza do DNA, obtida a uma densidade óptica (DO) de 260/280nm, houve uma variação entre 0,21±0,12 para “Easy spin kit” (Citomed) e 1,82±0,34 para “High pure PCR template preparation kit” (Roche). DISCUSSÃO: O método de extracção manual modificado revelou-se o mais eficiente na extracção. Em relação à pureza do DNA obtido, os que melhores razões obtiveram foram o “High pure PCR template preparation kit” (Roche, Portugal) e o método de extracção manual (modificado), sendo que todos os outros registaram valores que indicam a presença de impurezas no DNA. Assim, poderemos inferir que o melhor kit para a extracção de DNA de E.granulosus é o método manual (modificado), visto ser aquele que maior quantidade de DNA extrai.

F. hepatica é o agente etiológico da Fasciolose humana/animal, e tem a capacidade de parasitar diversas espécies animais, principalmente herbívoros e omnívoros (ovinos, bovinos, caprinos, etc.) onde pode ser encontrado no fígado e canais biliares, tendo também a capacidade, de acidentalmente infetar o Homem. Este parasita apresenta uma distribuição cosmopolita sendo mais frequente em regiões pantanosas sujeitas a inundações periódicas. Foi efetuada a extração de DNA de um exemplar de F. hepatica obtido no matadouro de Pedrogão Grande, através do método manual de fenol-clorofórmio. As regiões ribossomais intergénicas transcritas ITS1 e ITS2 foram amplificadas em duas reações separadas, com os primers BD1/4S (Bowles, et al., 1993c) e Dd58SF1/Dd28SR1 (Sharroks, 1994), respetivamente. Os produtos de amplificação das reações foram purificados com o kit “QIAquick PCR purification kit” e sequenciados pela empresa STAB VIDA (Portugal), através do método de Sanger. No final procedeu-se ao tratamento e análise filogenética das sequências obtidas através de software apropriado, culminando com a criação de redes filogenéticas pelo programa SplitsTree4, usando distâncias calculadas através do parâmetro Kimura-2 no algoritmo Neighbor-Net. Após se efetuar a amplificação regiões alvo (ITS1 e ITS2) e respetiva análise filogenética verificou-se que estas eram diferentes de todas as que estavam descritas na base de dados do GenBank. A região ITS1 do exemplar estudado está mais próxima filogeneticamente de amostras do continente asiático (AJ628432, AJ628431, EF612469 e EF612468), do continente africano (EF612467 e EF198867) e do continente americano (AJ243016), com um único local polimórfico de diferença entre as sequências referidas e a sequência estudada. A região ITS2 estava próxima filogeneticamente de sequências descritas um pouco por todo o mundo, apresentando 2 locais polimórficos em relação às sequências descritas na base de dados. Este será portanto um novo haplótipo de ITS1 e ITS2 para F. hepatica e a primeira sequência obtida desta região para esta espécie em Portugal.

O céstode E. granulosus, agente causal da hidatidose/equinococose, está presente em diversas espécies de animais e, acidentalmente, em humanos. Este apresenta uma grande variabilidade genética, com dez genótipos diferentes descritos (G1 – G10), onde alguns destes já são considerados novas espécies. Estes genótipos encontram-se distribuídos um pouco por todo o mundo, inclusive Portugal. O presente trabalho teve como objectivo comparar diferentes métodos de extracção de DNA para E. granulosus, para optimização das técnicas de PCR utilizadas na sua caracterização molecular. Procedeu-se à extracção de DNA de 20 amostras usando 3 kits comerciais, “High pure PCR template preparation kit”, “Easy spin kit”, “QIAamp DNA mini kit” e a extracção manual de fenol-clorofórmio (Sambrook, 1989), com algumas modificações. Posteriormente, foi efectuada a quantificação do DNA extraído, do grau de pureza e da quantidade de sais por densidade óptica (DO) a 230nm, 260nm e 280nm (GeneQuant, BIORAD). Foi também tido em conta o tempo que demora cada extracção e o seu custo. Para de facto termos a certeza que se tratava de E.granulosus, efectuou-se a amplificação do gene mitocondrial ND1, recorrendo aos primers JB11, JB12 . Os resultados obtidos provam que o melhor método para a extracção de DNA de E.granulosus é o método manual fenol-clorofórmio (modificado) e que se tratava de E.granulosus, visto que ocorreu amplificação com os primers JB11 e JB12.