Avaliação do Ficol como crioprotetor de ovócitos imaturos com posterior descongelação, maturação e fecundação in vitro
Type
masterThesis
Identifier
201059843
Title
Avaliação do Ficol como crioprotetor de ovócitos imaturos com posterior descongelação, maturação e fecundação in vitro
Contributor
Andrade, Luís Pedro Mota Pinto de
Silva, Joaquim Fernando Moreira da
Silva, Joaquim Fernando Moreira da
Subject
Gado bovino
Criopreservação
Ficol
Ovócito
Toxicidade
Criopreservação
Ficol
Ovócito
Toxicidade
Date
2014-10-17T13:30:01Z
2014-10-17T13:30:01Z
2014
2014-10-17T13:30:01Z
2014
Description
Relatório de Estágio apresentado à Escola Superior Agrária do Instituto Politécnico de Castelo Branco
para cumprimento dos requisitos necessários à obtenção do grau de Mestre em Engenharia Zootécnica.
Os objetivos do presente trabalho foram a avaliação da capacidade de fecundação in vitro e posterior desenvolvimento até ao estado de mórula compacta/blastocisto após congelação/descongelação de ovócitos imaturos bovinos, recorrendo ao ficol como crioprotetor. Desta forma foram então utilizados um total de 134 ovários recolhidos no Matadouro dos quais foram puncionados 1245 cumulus complexos ovocitários (COCs) classificados com classe A e B sendo estes divididos em dois grupos de trabalho: Grupo 1 - Avaliação da toxicidade dos crioprotetores (n=691); Grupo 2 - Avaliação da vitrificação de ovócitos (n=554). Os ovócitos pertencentes ao Grupo 1 foram usados para a avaliação do Ficol como crioprotetor sendo os resultados avaliados pela taxa de desenvolvimento nuclear após a sua maturação. Após observar que o Ficol não é toxico para os COCs, foi desenvolvida a segunda parte do trabalho (Grupo 2), onde após a descongelação, os ovócitos foram fecundados in vitro sendo avaliado o estado de desenvolvimento embrionário. No que concerne aos resultados da expansão das células do cumulus oophurus, observou-se uma menor taxa de expansão dos cumulus dos ovócitos submetidos ao meio de vitrificação contendo apenas DMSO (88,7±2,6), quando comparados com os resultados do DMSO + Ficol (91,8±2,2) (p <0,05). No grupo controlo a taxa de maturação avaliada por este critério foi de 92,9± 1.6, sendo também estatisticamente superior ao grupo onde foi apenas usado DMSO como crioprotetor (P<0,05). Na avaliação da taxa de maturação, recorrendo ao desenvolvimento nuclear, não foram registadas diferenças significativas na percentagem de ovócitos maturados, submetidos ao meio de vitrificação contendo DMSO (48,8%) quando comparados com os valores obtidos pelo grupo controlo (51,0%). A suplementação do meio de vitrificação com o Ficol não demonstrou nenhuma melhoria no desenvolvimento nuclear (44,1%) porém não se verificou que este crioprotetor tenha uma ação negativa no progresso de maturação nuclear. Em relação a taxa de sobreviventes, observa-se então uma diferença significativa (p <0,05), entre o grupo do DMSO (94.5±1.4%) e o controlo (100%) (p<0,05) sendo menor no grupo do DMSO + Ficol (85.6±7.0) (p<0,05). Em relação aos resultados referentes ao desenvolvimento embrionário no estado de 2 – 8 células, foram superiores no grupo controlo (67.9±5.1), sendo DMSO 26.5 (±1.8%) para o DMSO e 17.4 (±1.1%) e DMSO + Ficol (p<0,05). Nos restantes estados de desenvolvimento embrionário as diferenças observadas entre o DMSO (21.5±2.1%) e o DMSO + Ficol (22.3±5.7%) não foram estatisticamente significativas, no entanto o grupo controlo (52.0±8.4%) obteve sempre percentagens superiores, sendo estas diferenças significativas (P <0.05). Podemos então concluir que o Ficol ao não ser toxico para os ovócitos imaturos de bovinos trata-se de um crioprotetor com ação benéfica na maturação nuclear para o processo de vitrificação, pois protege os ovócitos da elevada toxicidade do DMSO.
The main objectives of this study were to assess the ability of in vitro fertilization and subsequent development to the state of morula/blastocyst after freezing/thawing of immature oocytes bovine, using ficol as cryoprotectant. Thus a total of 134 ovaries collected at a local abattoir of which 1245 cumulus oocytes complex (COCs), classified as class A and B were divided into two groups: Group 1: - Evaluation of the toxicity of cryoprotectants (n=691) and Group 2 – Rating of development after in vitro fertilization after oocyte’s vitrification (n=554). The oocytes in Group 1 were used to evaluate the toxicity of the cryoprotectant Ficol and the results were evaluated by the rate of nuclear maturation development. After noting that the Ficol is not toxic to COCs, the second part of the work (Group 2) was developed, where after thawing, the oocytes were fertilized in vitro and evaluated the state of development and maturation of embryos. Regarding the results of expanding cumulus cells oophurus, there was a lower rate of expansion of the cumulus of the oocytes undergoing vitrification medium containing DMSO alone (88.7±2.6 %) compared with the results of + DMSO Ficol (91.8 ± 2.2 %) (p<0.05). In the control group the rate of maturation evaluated by this criterion was 92.9 (±1.6%), being also statistically superior as compared to the group which was only used as a cryoprotectant DMSO (P<0.05). COC’s maturation rate, using the nuclear development, no significant differences were recorded in the percentage of matured oocytes subjected to vitrification medium containing DMSO (48.8 %) when compared with values obtained for the control group (51.0 %). The vitrification medium supplementation with Ficol showed no improvement in nuclear development (44.1%), besides this cryoprotectant has a negative action in the progress of nuclear maturation. Regarding the rate of survivors, it was observed a significant difference (p<0.05) between the group of DMSO (94.5 ± 1.4 %) and control (100 %) (p<0.05), being lower in the DMSO+Ficol group (85.6 ± 7.0) (p<0.05). Results for the embryonic development in the state 2-8 cells, were higher in the control group (67.9 ± 5.1 %), being 26.5 (± 1.8 % ) for DMSO and 17.4 (± 1.1 % ) for DMSO+Ficol (P<0.05). In the other stages of embryonic development the differences observed between the DMSO (21.5 ± 2.1 % ) and DMSO + Ficol (22.3 ± 5.7 % ) were not statistically significant, however the control group (52.0 ± 8.4 %) always got higher percentages of development (p<0.05). We can then conclude that the Ficol is not toxic to the immature bovine oocytes, and can act as beneficial for the vitrification process, protecting oocytes from high toxicity of DMSO.
Os objetivos do presente trabalho foram a avaliação da capacidade de fecundação in vitro e posterior desenvolvimento até ao estado de mórula compacta/blastocisto após congelação/descongelação de ovócitos imaturos bovinos, recorrendo ao ficol como crioprotetor. Desta forma foram então utilizados um total de 134 ovários recolhidos no Matadouro dos quais foram puncionados 1245 cumulus complexos ovocitários (COCs) classificados com classe A e B sendo estes divididos em dois grupos de trabalho: Grupo 1 - Avaliação da toxicidade dos crioprotetores (n=691); Grupo 2 - Avaliação da vitrificação de ovócitos (n=554). Os ovócitos pertencentes ao Grupo 1 foram usados para a avaliação do Ficol como crioprotetor sendo os resultados avaliados pela taxa de desenvolvimento nuclear após a sua maturação. Após observar que o Ficol não é toxico para os COCs, foi desenvolvida a segunda parte do trabalho (Grupo 2), onde após a descongelação, os ovócitos foram fecundados in vitro sendo avaliado o estado de desenvolvimento embrionário. No que concerne aos resultados da expansão das células do cumulus oophurus, observou-se uma menor taxa de expansão dos cumulus dos ovócitos submetidos ao meio de vitrificação contendo apenas DMSO (88,7±2,6), quando comparados com os resultados do DMSO + Ficol (91,8±2,2) (p <0,05). No grupo controlo a taxa de maturação avaliada por este critério foi de 92,9± 1.6, sendo também estatisticamente superior ao grupo onde foi apenas usado DMSO como crioprotetor (P<0,05). Na avaliação da taxa de maturação, recorrendo ao desenvolvimento nuclear, não foram registadas diferenças significativas na percentagem de ovócitos maturados, submetidos ao meio de vitrificação contendo DMSO (48,8%) quando comparados com os valores obtidos pelo grupo controlo (51,0%). A suplementação do meio de vitrificação com o Ficol não demonstrou nenhuma melhoria no desenvolvimento nuclear (44,1%) porém não se verificou que este crioprotetor tenha uma ação negativa no progresso de maturação nuclear. Em relação a taxa de sobreviventes, observa-se então uma diferença significativa (p <0,05), entre o grupo do DMSO (94.5±1.4%) e o controlo (100%) (p<0,05) sendo menor no grupo do DMSO + Ficol (85.6±7.0) (p<0,05). Em relação aos resultados referentes ao desenvolvimento embrionário no estado de 2 – 8 células, foram superiores no grupo controlo (67.9±5.1), sendo DMSO 26.5 (±1.8%) para o DMSO e 17.4 (±1.1%) e DMSO + Ficol (p<0,05). Nos restantes estados de desenvolvimento embrionário as diferenças observadas entre o DMSO (21.5±2.1%) e o DMSO + Ficol (22.3±5.7%) não foram estatisticamente significativas, no entanto o grupo controlo (52.0±8.4%) obteve sempre percentagens superiores, sendo estas diferenças significativas (P <0.05). Podemos então concluir que o Ficol ao não ser toxico para os ovócitos imaturos de bovinos trata-se de um crioprotetor com ação benéfica na maturação nuclear para o processo de vitrificação, pois protege os ovócitos da elevada toxicidade do DMSO.
The main objectives of this study were to assess the ability of in vitro fertilization and subsequent development to the state of morula/blastocyst after freezing/thawing of immature oocytes bovine, using ficol as cryoprotectant. Thus a total of 134 ovaries collected at a local abattoir of which 1245 cumulus oocytes complex (COCs), classified as class A and B were divided into two groups: Group 1: - Evaluation of the toxicity of cryoprotectants (n=691) and Group 2 – Rating of development after in vitro fertilization after oocyte’s vitrification (n=554). The oocytes in Group 1 were used to evaluate the toxicity of the cryoprotectant Ficol and the results were evaluated by the rate of nuclear maturation development. After noting that the Ficol is not toxic to COCs, the second part of the work (Group 2) was developed, where after thawing, the oocytes were fertilized in vitro and evaluated the state of development and maturation of embryos. Regarding the results of expanding cumulus cells oophurus, there was a lower rate of expansion of the cumulus of the oocytes undergoing vitrification medium containing DMSO alone (88.7±2.6 %) compared with the results of + DMSO Ficol (91.8 ± 2.2 %) (p<0.05). In the control group the rate of maturation evaluated by this criterion was 92.9 (±1.6%), being also statistically superior as compared to the group which was only used as a cryoprotectant DMSO (P<0.05). COC’s maturation rate, using the nuclear development, no significant differences were recorded in the percentage of matured oocytes subjected to vitrification medium containing DMSO (48.8 %) when compared with values obtained for the control group (51.0 %). The vitrification medium supplementation with Ficol showed no improvement in nuclear development (44.1%), besides this cryoprotectant has a negative action in the progress of nuclear maturation. Regarding the rate of survivors, it was observed a significant difference (p<0.05) between the group of DMSO (94.5 ± 1.4 %) and control (100 %) (p<0.05), being lower in the DMSO+Ficol group (85.6 ± 7.0) (p<0.05). Results for the embryonic development in the state 2-8 cells, were higher in the control group (67.9 ± 5.1 %), being 26.5 (± 1.8 % ) for DMSO and 17.4 (± 1.1 % ) for DMSO+Ficol (P<0.05). In the other stages of embryonic development the differences observed between the DMSO (21.5 ± 2.1 % ) and DMSO + Ficol (22.3 ± 5.7 % ) were not statistically significant, however the control group (52.0 ± 8.4 %) always got higher percentages of development (p<0.05). We can then conclude that the Ficol is not toxic to the immature bovine oocytes, and can act as beneficial for the vitrification process, protecting oocytes from high toxicity of DMSO.
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